PCR檢測(cè)試劑盒：從樣本處理到結(jié)果分析的關(guān)鍵細(xì)節(jié)
一、使用前準(zhǔn)備：環(huán)境、試劑與個(gè)人防護(hù)
環(huán)境要求
選擇干凈、無塵、無風(fēng)且已消毒的操作區(qū)域，避免交叉污染。
實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面需用紫外燈照射30-60分鐘滅菌，照射距離保持60-90cm。
試劑準(zhǔn)備
儲(chǔ)存條件：試劑盒需在-20℃以下避光保存，使用前恢復(fù)至室溫（避免反復(fù)凍融，建議分裝后單次使用）。
試劑配制：使用高質(zhì)量雙蒸水（0.22μm濾膜過濾或高壓滅菌），按說明書要求配制緩沖液、洗滌液等。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：
標(biāo)記離心管，用帶芯槍頭加入45μL稀釋液。
逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，全程冰上操作。
個(gè)人防護(hù)
穿戴手套、口罩、實(shí)驗(yàn)服，必要時(shí)佩戴護(hù)目鏡，防止試劑接觸皮膚或吸入。
二、樣本處理：提取與純化核心步驟
樣本采集與保存
細(xì)胞、組織或培養(yǎng)基樣本需2-8℃保存，血液樣本需抗凝處理。
避免使用金屬部分接觸樣本，防止核酸降解。
核酸提取
裂解：加入蛋白酶K和裂解液，渦旋振蕩后56℃孵育10分鐘。
純化：
加入無水乙醇沉淀核酸，轉(zhuǎn)移至吸附柱中離心棄液。
用洗滌液（如DNA洗滌液）清洗吸附柱，13000rpm離心3分鐘以去除殘留雜質(zhì)。
加入洗脫液（如DNA洗脫液）室溫放置1分鐘后離心，收集核酸溶液。
質(zhì)量控制
測(cè)定核酸濃度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。
避免使用渾濁或沉淀的樣本，必要時(shí)重新提取。
三、PCR反應(yīng)體系配置：精準(zhǔn)操作避污染
反應(yīng)體系組成
20μL體系示例：
PCR反應(yīng)液：16μL（含引物、dNTPs、緩沖液）
TaqDNA聚合酶：2μL
模板DNA：2μL（根據(jù)樣本濃度調(diào)整）
礦物油（可選）：覆蓋反應(yīng)液防止蒸發(fā)（有熱蓋的PCR儀無需使用）。
加樣順序與技巧
使用帶芯槍頭避免交叉污染，加樣后輕柔混勻并短暫離心。
設(shè)置對(duì)照：
陽性對(duì)照：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或陽性樣本。
陰性對(duì)照：用雙蒸水或無模板緩沖液代替模板DNA。
空白對(duì)照：不加入任何試劑，檢測(cè)環(huán)境污染。
反應(yīng)條件設(shè)定
預(yù)變性：94-95℃3-5分鐘（解開DNA雙鏈）。
循環(huán)擴(kuò)增：
變性：94-95℃30秒
退火：50-60℃30秒（根據(jù)引物Tm值調(diào)整）
延伸：72℃30-60秒（根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度調(diào)整，如1kb/分鐘）
循環(huán)數(shù)：25-40次（通常35次足夠擴(kuò)增至檢測(cè)限）。
最終延伸：72℃5-10分鐘（確保所有片段延伸）。
四、結(jié)果分析：熒光信號(hào)解讀與質(zhì)量控制
熒光信號(hào)檢測(cè)
使用熒光定量PCR儀讀取Ct值（循環(huán)閾值），Ct值越小表示初始模板濃度越高。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以陽性對(duì)照濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，Ct值為縱軸，計(jì)算線性回歸方程（R²≥0.99為合格）。
結(jié)果判定
定量分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中目標(biāo)DNA的拷貝數(shù)。
定性分析：
陰性對(duì)照無Ct值或Ct≥40，陽性對(duì)照Ct≤35且擴(kuò)增曲線呈典型S形。
樣本Ct≤40且擴(kuò)增曲線正常判定為陽性；無Ct或Ct≥40判定為陰性。
異常處理
翹尾現(xiàn)象：復(fù)查樣本或重新提取核酸，排除實(shí)驗(yàn)室污染（如環(huán)境樣本或陰性對(duì)照檢測(cè)）。
弱陽性擴(kuò)增：檢查試劑有效期、反應(yīng)條件或重新采樣驗(yàn)證。
400-166-8600
當(dāng)前位置：