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德國(guó)Minerva Biolabs公司提供的PCR Clean™是針對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的核酸污染祛除試劑，對(duì)比其濕巾和噴霧劑在常見的儀器、物品的污染祛除效果進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行了詳細(xì)的闡釋。
科研人員測(cè)試了PCR Clean™和PCR Clean™Wipes對(duì)玻璃表面dna酶的祛除能力。簡(jiǎn)而言之，DNase I(1µl, 3u /µl, Applichem, Cat.；將No.A3778.0010)移液到玻璃表面風(fēng)干。接下來(lái)，用干紙巾、70%異丙醇浸泡液、PCR Clean™浸泡液或PCR Clean™ Wipes擦拭。
使用基因組DNA （gDNA）標(biāo)準(zhǔn)物作為底物/指示劑，通過(guò)qPCR間接測(cè)量DNA酶的酶活性來(lái)鑒定持續(xù)的DNA酶污染。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，在擦拭步驟后，將20µl gDNA （M.gallisepticum，10^3個(gè)基因組拷貝/µl， 10mM MgCl2在PCR級(jí)水中）添加到DNA預(yù)包被的點(diǎn)上。
然后通過(guò)上下移液10次收集污染的DNase及其底物gDNA的混合物，并在37°C下孵育15分鐘，以允許酶促反應(yīng)（消化）發(fā)生。
然后通過(guò)評(píng)估m(xù)icrostart®ATMP支原體（Sartorius STEDIM Biotech） qPCR擴(kuò)增的性能來(lái)推斷由于污染DNA酶引起的相關(guān)DNA降解。作為qPCR反應(yīng)wan quan受損的參考，科研人員納入陽(yáng)性對(duì)照，采用20µl的gDNA（10^3個(gè)基因組拷貝/µl）在37℃下孵育15分鐘，獲得陽(yáng)性對(duì)照。同樣的程序用于產(chǎn)生陰性對(duì)照，不添加DNase I。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在用不同方法進(jìn)行去污后，通過(guò)在DNase污染點(diǎn)上添加gDNA（雞毒支原體，103 C/µl）的qPCR來(lái)評(píng)估DNase（3 U）的有效祛除率。
在qPCR之前，從污染的玻璃表面收集gDNA和DNase的混合物，并在酶反應(yīng)的**條件下孵育。當(dāng)沒(méi)有觀察到qPCR反應(yīng)受影響時(shí)，認(rèn)為凈化完成。這是通過(guò)用PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕的紙巾擦拭來(lái)實(shí)現(xiàn)的，正如成功擴(kuò)增摻入的gDNA所證明的那樣。
從PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕紙巾處理過(guò)的表面樣本中，獲得的摻入gDNA的Ct值與陰性對(duì)照相當(dāng)，在gDNA摻入之前沒(méi)有吸過(guò)DNase（表5）。
省略擦拭步驟，使用干燥的紙巾或用70%異丙醇潤(rùn)濕的毛巾，通過(guò)之前添加的DNase誘導(dǎo)gDNA大量降解（無(wú)Ct，表5）。在陽(yáng)性對(duì)照組中觀察到類似的wan quan降解，在**反應(yīng)條件下允許DNases誘導(dǎo)的DNA降解發(fā)生。圖5顯示了閾值以上的清晰擴(kuò)增曲線，僅適用于經(jīng)PCR Clean™處理的表面和陰性對(duì)照，從而證實(shí)了qPCR性能因所用祛除劑而異。
表5.使用隨后的DNA回收作為去污效率的指標(biāo)，在表面清潔后殘留的DNA酶活性。該表顯示了與對(duì)照組相比，摻入DNase預(yù)涂玻璃表面的gDNA的qPCR Ct值，后來(lái)用幾種方法擦拭。通過(guò)**酶消化（陽(yáng)性對(duì)照）獲得的擴(kuò)增缺失（無(wú)Ct）表明DNA明顯依賴于DNA酶降解，阻礙了qPCR。同樣，低效的凈化方法也會(huì)導(dǎo)致qPCR受損。斑點(diǎn)靶標(biāo)的成功擴(kuò)增（在陰性對(duì)照的2 Ct值內(nèi)）表明，之前污染的DNase被顯著祛除。
圖5.在應(yīng)用了幾種清潔方法后，在DNase污染的玻璃表面上添加gDNA的qPCR擴(kuò)增曲線與對(duì)照條件進(jìn)行了比較（詳見下文圖例）。
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