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對于分子生物學(xué)實驗來說，祛除DNA、RNA、核酸酶污染十分重要，是保證實驗結(jié)果穩(wěn)定的關(guān)鍵因素之一。
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由小RNA介導(dǎo)的保守的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。它在真核生物的基因調(diào)控、腫瘤進(jìn)展、抗病毒防御和控制基因組轉(zhuǎn)座因子等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。
在這一途徑中，Argonaute (Ago)蛋白，作為rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的組成部分，利用其結(jié)合的小非編碼rna通過互補(bǔ)堿基配對識別靶rna。這些小RNA可以是由短發(fā)夾RNA (pre-miRNA)產(chǎn)生的microRNAs (miRNAs)，也可以是由雙鏈RNA (dsRNA)產(chǎn)生的小干擾RNA (sirna)，它們都是21-25核苷酸(nt)雙鏈，在5 '端有磷酸，在3 '端有一個2-nt懸垂末端，羥基末端在5 '端。
在哺乳動物中，miRNA和siRNA由相同的RNase-III酶Dicer產(chǎn)生，而在果蠅中，它們通常不僅由不同的Dicer (DmDcr-1和DmDcr-2)產(chǎn)生，而且分別被分類為功能不同的Argonaute蛋白，如DmAgo1和DmAgo2。
Dicer是RNase-III酶家族的一員，在真核生物中高度保守。它由多個結(jié)構(gòu)域組成，包括n端DExD/H解旋酶(helicase)結(jié)構(gòu)域、cap結(jié)構(gòu)域(Platform結(jié)構(gòu)域和PAZ結(jié)構(gòu)域)、具有兩個RNase-III結(jié)構(gòu)域的核心區(qū)和c端雙鏈rna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)。這些結(jié)構(gòu)域的排列和協(xié)作對于確定RNase iii切割的RNA分子的精確長度和結(jié)構(gòu)特征至關(guān)重要。HsDicer (Human Dicer)和DmDcr-1中的解旋酶結(jié)構(gòu)域?qū)?span>dsrna結(jié)合的親和力較低，缺乏水解ATP的能力。因此，它們的主要底物僅限于短發(fā)夾狀的pre-miRNA。相比之下，DmDcr-2的解旋酶結(jié)構(gòu)域不同于HsDicer或DmDcr-1，因為它可以高親和力地與dsRNA結(jié)合，并促進(jìn)ATP水解，將dsRNA底物轉(zhuǎn)運(yùn)到RNA加工中心。
當(dāng)小RNA雙工前體被Dicer蛋白加工時，由多個dsRBDs組成的輔因子dsrna結(jié)合蛋白(dsRBPs)協(xié)助Dicer完成切割過程，并將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到Argonaute蛋白。在這些輔助因子中，哺乳動物的TRBP/PACT和果蠅的R2D2/ Loqs已經(jīng)得到了很好的研究。這些輔因子以化學(xué)計量比與Dicer結(jié)合，并影響其裂解活性、產(chǎn)物長度和產(chǎn)物傳遞等。所有的dsrbd都有一個共同的α -β -β -β - α-折疊，但根據(jù)它們與dsrna的結(jié)合能力，它們可以分為兩類。A型dsrbd具有類似的與序列無關(guān)的dsrna結(jié)合方式，而B型dsrbd沒有dsrna結(jié)合活性20,21。TRBP/PACT和Loqs-PA/Loqs-PB分別有2個A型dsRBD和1個B型dsRBD結(jié)合HsDicer和DmDcr-1，分別為。R2D2和Loqs異構(gòu)體D (Loqs- pd)有兩個A型dsrbd，作為dmdcr -2的伴侶蛋白。
一般認(rèn)為，DmDcr-2產(chǎn)生兩種siRNA，一種是防御病毒的外siRNA，另一種是保護(hù)基因組完整性免受轉(zhuǎn)座元件嚴(yán)重威脅的內(nèi)siRNA(或esiRNAs)。在dsRNA底物的切割過程中，DmDcr-2被觀察到多種構(gòu)象狀態(tài)，包括易位狀態(tài)、主動切割狀態(tài)和切割后狀態(tài)等。loq - pd的存在通過增加解旋酶域的初始dsrna結(jié)合率來增強(qiáng)DmDcr-2的加工活性。在dsRNA底物切割后，R2D2幫助DmDcr-2利用Hsp70/90伴體系統(tǒng)將產(chǎn)物siRNA雙工引導(dǎo)到RNA干擾效應(yīng)物Ago2中，而不是增強(qiáng)其切割活性。因此，R2D2是RISC加載復(fù)合體(RLC)的重要組成部分。據(jù)報道，loq - pd和R2D2在siRNA途徑中依次作用，并且它們是由外源性或內(nèi)源性dsRNAs35觸發(fā)的常見沉默。
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