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支原體檢測的應(yīng)用
支原體是細(xì)胞實驗中，常見的一類污染物。
在干細(xì)胞治療、免疫細(xì)胞治療、CAR-T、抗體藥生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)相關(guān)的等臨床臨床項目，以及細(xì)胞典藏等重大的細(xì)胞培養(yǎng)項目，都需要進行支原體放行檢測，以確保產(chǎn)物沒有支原體污染。
?因此，需要建立結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡便快捷、通過《藥典》方法驗證的檢測手段。
產(chǎn)品名稱：支原體qPCR檢測試劑盒 (經(jīng)典法)
英文：Venor®Gem qEP
貨號：11-9025
品牌：Minerva Biolabs®
規(guī)格：25次/盒
特點：遵循歐洲藥典和日本藥典檢查的流程，通過方法學(xué)驗證；靈敏度高；特異性強，操作便捷。
產(chǎn)品用途
德國Minerva Biolabs公司的Venor® GeM qEP kit，用于定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)物，及其他生物基質(zhì)中的柔膜體綱微生物，如支原體、無膽甾原體、螺原體。
作用原理
通過擴增16S rRNA編碼區(qū)特異性檢測支原體，而真核生物和其他細(xì)菌DNA不能通過Venor®GeM qEP Kit擴增。
試劑盒包含所有必要的PCR組分，內(nèi)控DNA可用于鑒定PCR抑制，或DNA抽提問題帶來的假陰性。內(nèi)控DNA可直接加到PCR預(yù)混液里，或加到DNA抽提之前的樣本中。它可用于驗證DNA抽提和qPCR擴增過程。它可從Minerva廠家購買（貨號11-9905）。內(nèi)控對照的擴增結(jié)果在560nm檢測（HEX通道），而支原體的擴增在520nm檢測（FAM通道）。
試劑盒包括dUTP，它替代dTTP，方便用尿嘧啶DNA糖基酶（UNG）監(jiān)視假陽性。該試劑盒不包含UNG。
實驗前準(zhǔn)備
一、細(xì)胞培養(yǎng)篩查
細(xì)胞應(yīng)長滿90%以上。細(xì)胞上清可直接用于支原體檢查，無需再樣品制備。但上清中可能累積抑制PCR的物質(zhì)，此時有必要進行DNA抽提。未有證據(jù)表明，細(xì)胞培養(yǎng)基中的青鏈霉素存在抑制支原體或影響檢測的靈敏度的情況。
細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體數(shù)量平均為1×10^6/ml，至多為1×10^8/ml，足以滿足PCR的檢測要求。PCR的模板制備如下：
1.轉(zhuǎn)移500μl細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml EP管，蓋緊蓋。
2.樣本孵育95℃10分鐘。
3.樣本最大轉(zhuǎn)速離心（15s）以沉淀細(xì)胞碎片。
4.取2μl直接用于qPCR，或樣品儲存在4℃，最多6天。長期保存在-20℃。
二、符合藥典的樣品檢查
1、濃縮樣品（可選步驟）
樣品基質(zhì)可能對檢測方法的靈敏度有至關(guān)重要的影響。進一步提高檢測靈敏度的一種方法是收集和篩選比支原體DNA提取所需的更大樣本量的細(xì)胞培養(yǎng)上清(例如，Venor®GeM樣品制備試劑盒>200 μl)，并執(zhí)行樣品濃縮步驟。
①轉(zhuǎn)移≤1ml樣品上清至1.5ml離心管。
②離心≥10000 × g 15分鐘（或≥13000× g 6分鐘），以沉淀支原體顆粒。
③棄掉上清，用200ml Tris緩沖液（10mM Tris-HCl，pH8.4）重懸沉淀。
④樣本渦旋混勻，然后直接進行樣本穩(wěn)定化處理或DNA抽提。
2.樣品穩(wěn)定化
細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有高濃度的DNA酶，即使在較低的溫度下也會降解支原體DNA。因此，我們建議采取以下步驟來穩(wěn)定樣品。如果在樣品采集后立即進行DNA提取，則不需要此步驟。請注意，在樣品濃縮步驟之前，不能通過熱失活來穩(wěn)定樣品。
①轉(zhuǎn)移500ml細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml離心管。蓋上管蓋。
②95℃孵育10分鐘。
③最大速度進行樣本離心（15秒），以沉淀細(xì)胞碎片。
④樣本即可用于DNA抽提，或儲存在4℃，最多6天。長期保存在-18℃以下。
3.DNA 抽提
大量證據(jù)表明，DNA抽提可實現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法，但應(yīng)適合支原體基因組。我們推薦：
Venor®GeM Sample Preparation kits （貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動DNA抽提。
這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過大量驗證，具體流程參見試劑盒說明書。
注意事項
??由于細(xì)胞團塊對PCR反應(yīng)的負(fù)面影響，不能直接使用細(xì)胞團塊進行檢測。因此，細(xì)胞團塊，或其他生物材料，如疫苗、冷凍儲存和石蠟包埋的樣品，需要在PCR前提取DNA。
已知樣品中胎牛血清(FCS)含量(> 5%)會增加PCR抑制的可能性。為了避免假陰性結(jié)果，這些樣品可能需要在PCR之前，也需要進行DNA提取。
Venor®GeM qEP試劑盒與Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat：No. 56-1010/-1050/-1200)用于支原體DNA提取
??樣品濃縮步驟只適用于完整的支原體細(xì)胞。因此，應(yīng)避免在樣品濃縮之前進行“樣品穩(wěn)定"，即不能再濃縮前進行任何破壞細(xì)胞的程序(如熱失活)，請參見“2.樣品穩(wěn)定化"?？芍苯犹幚眢w積為200 μl的樣品，無需濃縮步驟。
??Venor®GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對照，也用于驗證DNA抽提步驟。
??樣本濃縮時不要加內(nèi)控DNA。
??內(nèi)控DNA可單獨購買（貨號11-9905）。
??PCR抑制可能因樣本基質(zhì)或者洗脫液產(chǎn)生。因而我們推薦Venor®GeM Sample Preparation kit用于DNA制備，其他品牌試劑盒需要經(jīng)過試驗以保證合格。
當(dāng)前位置：