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qPCR技術(shù)是分子生物實驗中，常見的一種幾首手段。使用Quantitative Real Time PCR擴增裝置即qPCR儀，通過不同的化學原理和數(shù)學原理，在PCR過程中實時監(jiān)測核酸擴增產(chǎn)物的技術(shù)。qPCR實現(xiàn)了通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。
qPCR的熒光標記方法分為以添加熒光基團核酸探針為主的熒光探針法，以綠色染料為主的熒光染料嵌合法。
利用不同化學原理設(shè)計的qPCR實驗，
實驗結(jié)果可能會產(chǎn)生不小的差距！
本期內(nèi)容，我們一起來聊聊這兩種常見的qPCR熒光標記方法有何不同，幫助大家選擇更符合自身實驗需求的方法。
熒光探針法
簡單來說，應(yīng)用該原理的熒光探針，是由熒光基團+DNA寡核苷酸+淬滅基團構(gòu)成。
探針由5’端標記有熒光報告基團、目標基因特異性結(jié)合的寡核苷酸序列以及3’端標記有淬滅基團以及與組成。
自然狀態(tài)下，探針完整，熒光報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，儀器不會檢測到熒光信號。
當存在目標序列時，目標DNA變性解鏈，熒光探針特異性結(jié)合到目標基因處。引物也結(jié)合在目標基因上，Taq酶又名DNA聚合酶，能將核苷酸添加到引物中，引物開始延伸。
Taq酶還具有5’-3’核酸外切酶活性。當引物延伸至探針結(jié)合處，可將探針水解，使熒光報告基團和淬滅基團分離，進而被qPCR儀檢測到熒光信號，熒光信號的強度與擴增得到的DNA的濃度成正比。
熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線"，通過熒光信號的強度反映出體系中雙鏈DNA的濃度。
熒光探針有許多不同種類，以應(yīng)對不同的實驗需求，該方法特異性高，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于基因檢測、病原體和病毒檢測、疾病耐藥基因篩查等領(lǐng)域。
德國MB支原體檢測試劑盒
Venor®Gem qEP
應(yīng)用熒光探針法對支原體DNA進行檢測，準確率高，使用方便。
熒光染料嵌合法
該方法用到一種非特異性雙鏈DNA熒光染料，被激發(fā)后，顯示為綠色熒光。
該染料以一種非特異性方式，與雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域相結(jié)合。游離的染料熒光信號微弱，在進行qPCR擴增生成dsDNA時，染料逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號被很大程度放大，熒光信號的強度與擴增得到的dsDNA的濃度成正比。
熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線"，通過熒光信號的強度反映出體系中dsDNA的濃度。
德國MB支原體qPCR檢測試劑盒，應(yīng)用熒光探針法原理，對支原體DNA進行檢測，具有特異性更強、靈敏度更高、可重復性更佳的特點。
支原體檢測方面，通過歐洲藥典和日本藥典方法學檢驗。
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