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細胞培養過程中，由于實驗環境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細胞發生支原體污染的頻率很高。據美國數據統計，細胞發生支原體污染的幾率在70%以上。
同時，由于支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實驗者肉眼發覺。而支原體污染是個循序的過程，普通抗生素對其無效。因此，被支原體污染的細胞會持續受到影響，導致實驗數據不準確。
支原體污染不僅是細胞培養中需要克服的現象，而且是制藥、生物制品生產中需要加以避免的。支原體污染的影響是什么？
●抑制細胞增殖達50%
●影響免疫反應
●影響病毒增殖和感染率
●引起染色體畸變和易位
●干擾雜交瘤技術使被污染細胞在HAT培養基更敏感
●在細胞壁上附著支原體會改變細胞壁完整性。
●降低電穿孔轉染率達5%
總之，支原體污染影響細胞所有的代謝功能。
細胞被支原體污染，解決方案
方法一：確認細胞已被支原體污染，終止試驗，丟棄所有被污染的細胞和耗材。
重新復蘇細胞，注意選用未被污染的細胞株、血清和培養基，并規范操作。
方法二：對于珍貴的，樣品不可再得的細胞，或價格昂貴的種子細胞，不但無法丟棄，而且作為種子細胞，還需要**支原體污染。
此時，需選用特異性的支原體殺除劑，清除污染，保護細胞。
目前世界上有效的方法是是德國的一款生物試劑，由Minerva公司生產，品名Mynox®。
此試劑可在2-3小時內將支原體主動殺除，但對細胞無毒害作用。特別適合細胞保種。
Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑，加入培養液中，可特異性地與支原體膜結合，改變膜通透性。通過此生物物理的方法，2～3小時內，即可把細胞中的支原體殺除掉。因為細胞膜結構與支原體膜不同，故Mynox®不會與細胞膜結合，因此無細胞毒性。
注意：3小時后，需將此試劑洗脫，將細胞更換到新的培養耗材和培養液中，重新培養。
此時，不應使用PCR方法檢測細胞中支原體。由于支原體解體，故PCR結果為假性強陽性。
具體操作流程見下圖：
Mynox®祛除貼壁細胞中支原體的流程圖
Mynox®殺除支原體功能強大有效，但由于價格昂貴，上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右，使得應用于細胞保種的數量受到價格的限制。
方法三：對于已耗費很多時間，大量擴增起來的細胞，或經過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞，如果發現細胞被支原體污染了，怎么辦？此時由于前期工作量巨大，使操作人員無法丟棄已有細胞。
但由于價格原因，又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體，
同時，實驗人員還需要清除細胞上的支原體污染，讓實驗得以往下推進，以終獲得準確的實驗數據。
此時，實驗者可選用對支原體*的抑制劑，通過對細胞的前期處理，中期加藥，逐步通過4代左右的培養，得以將支原體污染*清除，確保試驗順利推進，結果準確。
*此類試劑眾多，筆者周圍的實驗人做過很多嘗試，其中效果確切且性價比較高的當屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。
它的原理是：通過抑制支原體增殖中某種蛋白的合成，達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復合型的新型抗生素。
注：使用ZellShield®時，不需使用鏈青霉素。
操作步驟：
一步：研究發現，98%的支原體污染發生在細胞間隙。因此，首先要把細胞消化下來，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復三次。此時可將細胞上大部分的支原體去除，為進一步加藥抑制做好準備。
第二步：培養液中加入1%的ZellShield®，細胞進行正常培養。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著細胞的換液逐步減少，通過4代左右的培養，細胞中的支原體基本可被*清除。
此試劑價格約2800元/50ml，1%濃度使用，可保證大量細胞的實驗得以順利推進。性價比較高，但祛除過程時間稍長。
有些細胞保種中心，當珍貴細胞被支原體污染后，會將Mynox®和ZellShield®結合使用，效果確切，結果令人滿意。
工作環境中支原體污染，解決方案
如果實驗室的細胞經常發生支原體污染，則需考慮的污染源可能來以下幾個方面：
1、細胞種子被污染，解決方法參見以上“方法二”和“方法三”；
2、細胞培養中，使用未經嚴格過濾祛除支原體的牛血清。
某些血清生產廠，為低價占領市場同時還能獲得充足利潤，他們需要降低生產成本，所以會將生產中，成本高的100nm過濾三次的步驟縮減，導致血清成為支原體的污染源。
(標準的血清生產規范為：粗血清需經七次過濾，后三次為100nm加壓過濾，可以清除支原體)；
此情況需詳細考察血清供貨商的專業程度，通過索要《檢測報告》等書面文件為血清獲得更多質量保證。同時，對專業水平不高的血清供貨商，適當延長血清試用期。
3、潔凈臺、細胞培養箱內部、培養箱水槽、液氮罐，培養間內部的水浴鍋等環境被支原體污染，可對工作區域進行消毒。有以下三種方法：
A、甲醛高錳酸鉀熏蒸消毒
缺點：甲醛有刺激氣味，細胞間1-2周無法使用。
B、酒精擦拭
缺點：操作較為繁瑣，酒精容易揮發，消毒維持時間不長。
C、用專門清除支原體的噴霧劑或濕巾消毒
目前，被各大實驗室普遍使用的是Mycoplasma-offTM噴霧劑和濕紙巾。它添加了可主動殺除支原體的Mynox®試劑，可在 幾分鐘內將支原體確切殺除，無殘留，無腐蝕性，無致癌性。
對于移液器，門把手，電話等器材，可使用支原體清除濕巾。擦拭后，應讓其被消毒物體的表面保持濕潤，再讓其自然風干。
D、培養箱水槽、培養間內部的水浴鍋
水槽經常會成為支原體以及真菌霉菌滋生的污染源。
解決方法：
水槽只需定期添水即可。
優點：操作方便，價格便宜。
總之，細胞培養中，支原體污染發生頻繁。有時帶來的危害會造成實驗的巨大損失。應經常檢測和及時排除支原體污染，讓細胞在健康安全的環境下生長，為獲得準確的實驗結果，打下良好的基礎。
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