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在生物制品和細(xì)胞治療領(lǐng)域，支原體檢查是保證產(chǎn)品和治療安全的重要一環(huán)。生物源性原材料、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體，以及細(xì)胞或基因治療產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程的不同階段都要進(jìn)行支原體污染的檢查。
傳統(tǒng)支原體檢查方法是培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法，并為藥典所認(rèn)可和收錄。近年來(lái)，『支原體qPCR檢測(cè)』在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多，但在項(xiàng)目申報(bào)前，先需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，依據(jù)藥典，在檢測(cè)限、特異性和耐用性方面達(dá)到要求后，才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。
就筆者所知，在適合工業(yè)的支原體檢測(cè)和方法驗(yàn)證方面，德國(guó)Minerva Biolabs（簡(jiǎn)稱MB）公司已有很成熟的產(chǎn)品及商業(yè)化應(yīng)用，它不僅提供有符合藥典的『支原體qPCR檢測(cè)』試劑盒，而且有一系列支原體標(biāo)準(zhǔn)品及輔助產(chǎn)品，用于qPCR方法的全面驗(yàn)證。這些產(chǎn)品性價(jià)比也較高，許多客戶都在使用。
下面，筆者就『支原體qPCR檢測(cè)』方法驗(yàn)證的一般要求、德國(guó)MB公司提供的『支原體qPCR檢測(cè)』的方法驗(yàn)證產(chǎn)品闡述如下。
一、『支原體qPCR檢測(cè)』方法驗(yàn)證的一般要求
各國(guó)藥典對(duì)支原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法（簡(jiǎn)稱NAT法）的驗(yàn)證要求略有出入，但均要求對(duì)檢出限、特異性和耐用性進(jìn)行驗(yàn)證。在檢測(cè)方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進(jìn)行支原體檢測(cè)。
如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產(chǎn)商提供完整的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)外，還需要使用者驗(yàn)證試劑盒對(duì)其樣本的適用性，以及試劑盒表現(xiàn)出預(yù)期的性能（例如檢測(cè)限、耐用性、是否存在與細(xì)菌的交叉反應(yīng)）。這些必須由使用者自己來(lái)證明。
在檢出限驗(yàn)證中，歐洲藥典（簡(jiǎn)稱EP）規(guī)定了污染細(xì)胞的常見(jiàn)9種支原體，要求NAT如替代培養(yǎng)法，對(duì)這9種支原體的檢測(cè)限需均達(dá)到10CFU/ml。其中如果生產(chǎn)中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關(guān)節(jié)液支原體（M. synoviae）。
日本藥典（簡(jiǎn)稱JP）中的驗(yàn)證要求與EP基本一致，但在檢出限驗(yàn)證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗(yàn)證。
終待驗(yàn)證的支原體物種的選擇，在依據(jù)藥典基礎(chǔ)上，還需根據(jù)支原體污染風(fēng)險(xiǎn)大小而定。污染風(fēng)險(xiǎn)的影響因素有支原體寄生的宿主細(xì)胞的特異性、原材料的來(lái)源、產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域等。
德國(guó)MB公司提供有10CFUTM支原體高敏標(biāo)準(zhǔn)品，可同時(shí)用于檢測(cè)限和耐用性的驗(yàn)證。
關(guān)于檢測(cè)限和耐用性的檢測(cè)次數(shù)，有如下公式可參考：
檢測(cè)次數(shù) = 支原體物種數(shù) × 3 輪獨(dú)立檢測(cè) × 8個(gè)復(fù)孔/每個(gè)物種/每輪
以歐洲藥典規(guī)定的9種支原體為例，實(shí)際所需檢測(cè)次數(shù)為9 × 3 × 8 = 216 次檢測(cè)。
加上陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)模板對(duì)照以及特異性驗(yàn)證，預(yù)計(jì)規(guī)格為250次/盒的試劑盒較為適合。
在NAT法的特異性驗(yàn)證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系，應(yīng)優(yōu)先選擇進(jìn)行驗(yàn)證。
至于更具體的驗(yàn)證方案，還需要使用者針對(duì)自己的產(chǎn)品以及流程自行設(shè)計(jì)，德國(guó)MB公司也可協(xié)助完善。
下面列出的方法驗(yàn)證所需產(chǎn)品，具體有四個(gè)表，供使用者參考：
表1.『支原體qPCR檢測(cè)』方法驗(yàn)證所需產(chǎn)品
表2. 特異性驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)品
根據(jù)EP2.6.7，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系，適合用于特異性驗(yàn)證。因此下表列出的是這3個(gè)菌屬的產(chǎn)品。用戶也可選擇自己生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)遇到的細(xì)菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證。
表3. 其他輔助產(chǎn)品
表4. qPCR方法驗(yàn)證所需設(shè)備、儀器
希望以上信息能給您帶來(lái)幫助。
如您對(duì)以上產(chǎn)品感興趣，需要訂購(gòu)或進(jìn)一步咨詢?cè)斍椋?qǐng)聯(lián)系德國(guó)MB中國(guó)區(qū)總代理：北京締一生物科技有限公司。
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