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目前，支原體核酸檢測法（常規PCR、熒光定量PCR）應用較為廣泛，尤其在生物制藥和細胞治療領域，可以替代傳統的培養法和DNA染色法。但同時，各種品牌的支原體PCR和qPCR檢測試劑盒又良莠不齊，因此，對核酸法本身進行方法學驗證是非常必要的。
上對支原體核酸法的驗證提出了三項要求：檢測限、特異性和耐用性。在檢測限方面，歐洲藥典除了規定要達到10CFU/ml或100CFU/ml外，也指出可以用等量的支原體核酸拷貝數來表示。這時就需要選用合適的支原體核酸標準品。
的微生物污染防控公司Minerva Biolabs（以下簡稱德國MB公司），專門提供包括歐洲/日本藥典9種支原體在內的PCR定量標準品共14種，可進行10倍梯度稀釋，制備標準曲線，確定核酸法的檢測限，因而廣受藥廠的青睞。
德國MB公司提供的PCR定量標準品信息如下：
PCR定量標準品的物種 | 貨號 |
口腔支原體 | 52-0112 |
雞敗血支原體 | 52-0115 |
萊氏無膽甾原體 | 52-0116 |
發酵支原體 | 52-0117 |
肺炎支原體 | 52-0119 |
關節液支原體 | 52-0124 |
精氨酸支原體 | 52-0129 |
豬鼻支原體 | 52-0130 |
檸檬螺原體 | 52-0164 |
唾液支原體 | 52-0103 |
百日咳桿菌 | 52-5571 |
大腸埃希菌 | 52-0083 |
嗜肺軍團菌 | 52-0101 |
銅綠假單胞菌 | 52-0071 |
一、試劑盒組分：
試劑盒組分 | 數量 | 蓋子顏色 |
PCR定量標準品1×108基因組拷貝/管 | 1管凍干粉 | 綠色 |
Tris緩沖液，10mM Tris，pH8.5（用于溶解和稀釋標準品） | 2ml×3管 | 白色 |
說明：2-8℃保存。使用前，標準品溶解后在-18℃以下保存。避免反復凍融。
、質控保證
微生物在液體培養基中培養，并在對數生長期末期收集。DNA用酚氯fang抽提，繼而用過濾柱純化。DNA純度用分光光度計法測量，保證OD260/280≥1.8。微生物物種用Sanger測序法確定。
純化DNA的定量采用小牛胸腺DNA標準品進行光密度測量，進而用熒光法證實。DNA終稀釋，并調整為1×108基因組拷貝/管。稀釋倍數用qPCR分析證實。
三、操作步驟：
1、標準品復溶
（1）所有管短時離心。
（2）加入100μl Tris緩沖液到帶綠蓋的管中。
（3）室溫靜置5分鐘。
（4）渦旋振蕩10秒，再離心5秒。
（5）使用適當體積的DNA溶液直接用于PCR或直接稀釋，用于制備DNA標準曲線
2、制備10倍稀釋的DNA標準曲線
（1）使標準品和Tris緩沖液室溫達到平衡。
（2）標記每個1.5ml離心管。每個管加入90ml Tris緩沖液。
（3）標準品混勻離心。
（4）標準品1：加10μl標準品母液到第1管，蓋蓋并混勻。簡要離心。
（5）標準品2：從第1管中取出10μl到第2管，蓋蓋并混勻。簡要離心。
（6）標準品3：從第2管中取出10μl到第3管，蓋蓋并混勻。簡要離心。
（7）下面的管均重復以上步驟。推薦制備6個標準品（梯度稀釋）。
對于qPCR，使用梯度稀釋的DNA標準品，可制備標準曲線。大多數qPCR軟件允許通過標準曲線進行定量分析。這依賴于正確的設置，包括標準曲線的參數。為便于正確定量，要確定你的標準曲線樣品。使用者可以試用下列參數用于設置。體積決定了每個PCR反應的基因組拷貝數。
反應管編號 | 2μl樣品 | 5μl樣品 | 10μl樣品 |
1 | 2×105基因組拷貝 | 5×105基因組拷貝 | 1×106基因組拷貝 |
2 | 2×104基因組拷貝 | 5×104基因組拷貝 | 1×105基因組拷貝 |
3 | 2×103基因組拷貝 | 5×103基因組拷貝 | 1×104基因組拷貝 |
4 | 200基因組拷貝 | 500基因組拷貝 | 1000基因組拷貝 |
5 | 20基因組拷貝 | 50基因組拷貝 | 100基因組拷貝 |
6 | 2基因組拷貝 | 5基因組拷貝 | 10基因組拷貝 |
4、評估
使用梯度稀釋，qPCR檢測后Ct值會隨著DNA濃度下降而升高。通過Ct值和DNA樣本量產生一條標準曲線，未知樣本的濃度通過標準曲線可以計算。下列的擴增曲線是用德國MB公司的Venor®
GeM qEP試劑盒繪制的。所用儀器為CFX96 Touch熒光定量PCR儀。
總之，PCR定量標準品可提供低拷貝數的DNA標準品，因而可精zhun確定核酸法的檢測限。而10CFU的靈敏度標準品只能觀察是否能達到這一閾值，而無法確定終為多少。從這個角度說，PCR定量標準品具有自己*的優勢。
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