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繼上回的準(zhǔn)備篇和菌種篇，這回要真正測定了。在各個測定管孵育20小時以上獲得zui大濁度時，即可用渦旋振蕩器混勻，之后倒入1cm比色杯，在540nm處測定吸光度（OD值）。以未接種的對照管的OD值為0，依次測定標(biāo)準(zhǔn)管、樣本。如果對照管OD值＞0.1，或者標(biāo)準(zhǔn)管OD值變化＜40%，說明有雜菌或葉酸混入，需重做。
測完OD值后，以葉酸含量為橫坐標(biāo)，每個標(biāo)準(zhǔn)管OD均值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定樣品對應(yīng)的葉酸含量。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，有人發(fā)現(xiàn)OD值隨著葉酸濃度增加而增長趨緩, 略呈S形。若使用線性方法，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布在曲線兩側(cè)，求得的葉酸濃度不準(zhǔn)。建議使用EXCEL功能建立4階曲線方程，則曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合程度較好（1）。
圖1. 1階線性擬合
圖2. 4階線性擬合，優(yōu)于1階
采用直接提取法進(jìn)行的葉酸含量可按如下公式進(jìn)行計算。其前提是：每個樣品有2個管葉酸含量在0.10ng-0.80ng范圍內(nèi)，且各管間偏差小于10%。
計算公式：
葉酸含量（g/100g）= (C*V*f)/m * 0.1
C為樣品稀釋液葉酸濃度(ng/ml)，V為提取液定容體積（ml），f為樣本提取液稀釋倍數(shù)，m為樣本質(zhì)量（g），0.1為ng/g換算為g/100g的系數(shù)。
以上就是相對完整的測定過程，不僅適合嬰兒配方食品，也適合谷薯、果蔬、豆及堅果類食品，只不過樣品需要用酶解提取法。大致過程如下：準(zhǔn)確稱量適量試樣（0.2-2g葉酸），如堅果類是0.2-2g，至0.0001g，轉(zhuǎn)入100ml錐形瓶中，加30mlPBS（含抗壞血酸作為葉酸保護(hù)劑），混勻5分鐘后高壓滅菌。再加1ml雞胰腺溶液。對于蛋白和淀粉含量豐富的樣本，應(yīng)再加1ml蛋白酶和淀粉酶溶液。再加3至5滴甲苯后，37℃孵育16小時，再轉(zhuǎn)入100ml容量瓶，加水定容，過濾。
之所以采取酶解法，是因?yàn)樵谝恍┦称分腥~酸以蛋白結(jié)合的形式存在，以上提取方法是依據(jù)中國預(yù)防科學(xué)院食品與衛(wèi)生研究所對食品前提取方法進(jìn)行的研究(2)。該研究還發(fā)現(xiàn)，蔬菜樣品采用二次水解法效果比較好；葉酸在酸性和過堿性環(huán)境中破壞嚴(yán)重，因此樣品提取液和培養(yǎng)基pH值應(yīng)控制在6.8-7.2。
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參考文獻(xiàn)
1. 唐靚，等.國標(biāo)<食品中葉酸的測定>的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與計算.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 2009,19(7):
2.王竹. 樣品前處理對食物中葉酸測定的影響.衛(wèi)生研究. 2000, 29 (6):404-406
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