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正常人的血清葉酸水平正常為9.9ng / ml。在身體異常或得病時(shí)，葉酸水平會(huì)顯著變化。葉酸干酪培養(yǎng)基采用干酪乳桿菌（ATCC 7469）為測(cè)定用菌，用于葉酸的微生物法測(cè)定。該培養(yǎng)基是基于Flynn等人(1)的配方，并經(jīng)Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于維生素測(cè)定的測(cè)定菌通常需要三種培養(yǎng)基：維持培養(yǎng)基、接種培養(yǎng)基和測(cè)定用培養(yǎng)基。后者通常是化學(xué)限定的培養(yǎng)基，包含所有測(cè)定菌生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，但不含有待測(cè)的分子。類似的，葉酸干酪培養(yǎng)基包含干酪乳桿菌生長(zhǎng)所需的所有成分，但不包含葉酸。因而，添加一系列濃度增加的葉酸，會(huì)觀察到干酪乳桿菌生長(zhǎng)反應(yīng)的遞增。
干酪乳桿菌（ATCC 7469）的貯備菌制備是在AOAC推薦的乳桿菌瓊脂（貨號(hào)M366）試管穿刺接種培養(yǎng)，35-37°C孵育18-24小時(shí)后，試管儲(chǔ)存在冰箱里。每月轉(zhuǎn)接一次。測(cè)定菌液的制備是將貯備菌轉(zhuǎn)種到含10ml微量維生素檢測(cè)接種肉湯（貨號(hào)M133）或乳酸桿菌肉湯（貨號(hào)M367）的試管中。35-37°C孵育24小時(shí)后，在無菌條件下菌液離心，棄掉上清，再重懸于10ml的無菌葉酸干酪培養(yǎng)基中（貨號(hào)M543）。再像之前一樣沉淀，并清洗一次。zui后，清洗后的菌株重懸于10ml葉酸干酪培養(yǎng)基中，并用該培養(yǎng)基進(jìn)行1:100稀釋。1滴重懸液用于接種到每個(gè)測(cè)定管中。也可用0.85% NaCl代替培養(yǎng)基來清洗和稀釋。
由于滅菌條件，孵育溫度等因素會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)，并且每次不會(huì)*一樣，因此每次都應(yīng)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。10ml管內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品量為0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。
葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將20mg葉酸干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸餾水中。用0.1N NaOH調(diào)整溶液pH值為10.0，再用0.05N HCl調(diào)pH為 7.0。該溶液含有200g葉酸/ml。用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，則濃度為200ng/ml。再用999ml葉酸緩沖液A（貨號(hào)M544）稀釋1ml該溶液，則為0.2ng/ml的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。每管取0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml該溶液，配置即告完成。
血清樣本的保存：讓血液樣本凝固以分離血清。分離血清至干凈干燥的血清管，并離心除去存在的任何血細(xì)胞。小心操作，避免出現(xiàn)紅細(xì)胞的溶血。分裝血清樣本至于干凈干燥的試管中，每管5ml。每管加入25mg的抗壞血酸。-20°C以下溫度保存。
血清樣本的制備：解凍含有抗壞血酸的血清。向5ml樣品中加入45ml葉酸緩沖液A（M544）。孵育37℃90分鐘。然后15磅121℃高壓滅菌2.5分鐘。離心去除凝固的蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移至清潔干燥的管中。該透明溶液即可用作葉酸待測(cè)的樣本。
樣本葉酸濃度的測(cè)定步驟：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的制備好的血清提取物。加入5ml葉酸干酪培養(yǎng)基和足量的蒸餾水，使每個(gè)試管的總體積為10ml。15磅121°C滅菌5分鐘。冷卻試管并向每個(gè)試管中加入一滴接種液。35-37℃孵育18-24小時(shí)后進(jìn)行濁度讀數(shù)。讀數(shù)前將試管冷藏15-30分鐘以停止細(xì)菌生長(zhǎng)。620nm檢測(cè)吸光度。待測(cè)樣品中的葉酸含量應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定，不過要考慮樣品稀釋度。
應(yīng)非常小心，避免培養(yǎng)基和玻璃器具被污染。應(yīng)使用潔凈的無去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
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